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RT-kit(逆轉錄試劑盒)(R1011-R1012)

促銷: 780.00~3250.00
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R1011 (20次) R1012 (100次)

RT-PCR Kit(逆轉錄試劑盒)

產品說明

RT-PCR Kit(逆轉錄試劑盒)是專為兩步法RT-PCR第一步實驗配制的、具有高靈敏度的RT-PCR反應系統。該系統合理配備了與cDNA第一鏈合成反應相關的各種組分,優化的體系保證了M-MLV具有高效的逆轉錄酶活性,所得cDNA對后續的PCR或定量PCR實驗兼容性好,可用于檢測稀有基因的表達、從極少數細胞中定量檢測特定mRNA的表達水平、克隆特定基因的cDNA片段等。

M-MLV逆轉錄酶是由一個71 kD的單亞基組成的重組型DNA逆轉錄聚合酶??梢源呋?/span>RNADNARNA雜交鏈為模板的互補DNA 的聚合反應。本酶經修飾RNase H活性比普通的逆轉錄酶要弱很多,因此在合成第一鏈cDNA的過程中,可保證RNA的降解程度較低,從而使得率提高。

產品組分

貨號

R101120次)

R1012100次)

M-MLV200U/μl

20 μl

100 μl

RNasin40U/μl

12 μl

60 μl

Oligo d(T)15 Primer50 μM

20 μl

100 μl

Random primer50 μM

20 μl

100 μl

5xfirst-strand buffer

80 μl

400 μl

RNase-free ddH2O

1 ml

1 ml×5

dNTPs(10mM each)

50 μl

250 μl

R1011可進行20次逆轉錄反應,R1012可進行100次逆轉錄反應(20 μl 標準PCR反應體系,每次使用 M-MLV 1μl)。

M-MLV 儲存液

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)

200 mM NaCl

0.1 mM EDTA

1 mM DTT

0.01% NP-40

50% glycerol

 

5xfirst-strand buffer 成分

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)

375 mM KCl

15 mM MgCl2

50 mM DTT

 

質量檢測

逆轉錄酶活性檢測

使用[32P]dCTP作為標記,200 U M-MLV1μg、1.2 kbRNA為模板進逆轉錄反應,最低可得到120ngcDNA,所得cDNA長度 > 全長的90%。

核酸外切酶活性檢測

混合50ng的標記DNA RNA200U M-MLV反應緩沖液體系中,37℃溫浴1 h,檢測DNARNA降解都不到總量的1%。

 

適用范圍

第一鏈cDNA 合成

cDNA文庫構建

RT-PCR

引物延伸

3'5' RACE

 

注意事項

l  成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長的完整性并且不含逆轉錄酶的抑制劑,如EDTA SDS。用于cDNA合成反應的溶液試劑盡可能用DEPC進行處理,并在高壓滅菌后使用。有些試劑不能用高壓滅菌處理時,首先用經過滅菌的器具、水等配制溶液后,再將溶液進行過濾除菌處理。

l  為了增加貯存RNA樣品的穩定性,可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用RNA時,可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaCl0.2 M同時加入4倍體積的乙醇,室溫放置3-5 min,10,000 rpm離心5 min。

l  在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑(RNasin)以增加cDNA合成的長度和產量。在第一鏈合成反應中,RNase抑制劑在緩沖液和還原劑(如 DTT)存在的條件下加入,因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性,從而釋放出RNase。但是RNase抑制劑僅防止RNase A,B,C RNA的降解,并不能防止皮膚上的RNase,因此盡管使用了RNase抑制劑,也要小心不要從手指上引入RNase。

l  較高的保溫溫度有助于RNA二級結構的打開,增加反應的產量。

l  使用簡單的RNA純化方法即可獲得滿足RT-PCR反應的RNA,但為了保證實驗的成功率,建議使用GTC法(異硫氰酸胍法)制備的高純度RNA。

l  為防止RNA降解,應盡量避免反復凍融,最好保存于-70℃。

l  最佳的PCR反應條件,因PCR擴增儀的不同而不同,所以在使用您的樣品之前最好先試做一下control反應,以確定最佳的PCR反應條件。

l  cDNA產物應置于-20℃保存。

l  當以cDNA為模板進行PCR之前,使用RNase H處理cDNA,可以提高PCR反應的靈敏度。

 

操作步驟

1 在冰浴的無菌離心管中配制下列混合物

1-5μg RNA

1μl Oligo(dT)15 Random primer,

RNase-free ddH2O13.4μl;

2進行變性退火反應

70℃溫浴5 min,

簡短離心后冰浴5 min;

3在上述離心管中配制反轉錄反應液

4 μl  5×first-strand buffer

1 μl  dNTPs10 mM each

0.6μl  RNasin ,

1 μl   M-MLV;

4按下列條件進行反轉錄反應

Oligo (dT)15 42℃溫浴60 min;

Random primer 37℃溫浴60 min。

5終止反應

70℃溫浴5 min終止反應,置冰上進行后續實驗或-20℃保存。

6RNase-free ddH2O將反應體系稀釋到50μl,取2-5μl進行PCR擴增反應。

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